Στόχος αυτής της ενότητας είναι να διερευνηθεί πως διαφοροποιείται ο ρυθμός υπερπλασίας και υπερτροφίας του λευκού μυ σε άτομα με διαφορετικό ρυθμό ανάπτυξης και ποιες διαφορές παρατηρούνται στην έκφραση γονιδιακών δεικτών που σχετίζονται με την ανάπτυξη και την αύξηση του λευκού μυ σε άτομα διαφορετικού μεγέθους σε κρίσιμα αναπτυξιακά στάδια. Ακόμα αν η θερμοκρασία και η διατροφή επιφέρουν κρίσιμο επιγενετικό έλεγχο στο ρυθμό ανάπτυξης του λευκού μυ και ποια miRNAs εμπλέκονται σε αυτό τον έλεγχο.

Μελέτη της μικροδομής του λευκού μυ και πρότυπα έκφρασης μυϊκών γονιδίων

Οι μύες αναπτύσσονται και αυξάνουν σε μέγεθος μέσω δύο θεμελιωδών διαδικασιών: της δημιουργίας νέων ινών (υπερπλασία) και της αύξησης του μεγέθους των υπαρχουσών ινών (υπερτροφία). Οι δύο διαδικασίες ρυθμίζονται διαφορετικά σε όλη τη διάρκεια του κύκλου ζωής των ψαριών: η υπερπλαστική μυϊκή ανάπτυξη κυριαρχεί κατά τα αρχικά στάδια ανάπτυξης, ενώ η υπερτροφία κυριαρχεί αργότερα. Σε ψάρια που φτάνουν σε μεγάλο μέγεθος σώματος ενηλίκου όπως το μαγιάτικο, ο σχηματισμός νέων μυϊκών ινών παρουσιάζει τρεις διακριτές φάσεις κατά την οντογένεση:

• • την εμβρυϊκή μυογένεση που δημιουργεί δύο μορφολογικά και λειτουργικά διακριτούς μυϊκούς τύπους που σχηματίζουν το πρωτεύον μυοτόμιο,

• • την στρωματοποιημένη υπερπλασία, κατά την οποία οι ραχιαίες και κοιλιακές βλαστικές ζώνες προσθέτουν νέες λευκές μυϊκές ίνες σε διακριτά στρώματα, και

• • την μωσαϊκή υπερπλασία στην οποία στρατολογούνται βαθιά μυογενή βλαστικά κύτταρα (MPCs) για να συντηχθούν και να σχηματιστούν νέα μυοσωληνάρια ή να συμβάλουν στην αύξηση μεγέθους των υπαρχόντων μυϊκών ινών μετά τη μεταμόρφωση.

Το αποτέλεσμα είναι η δημιουργία μυϊκών ινών μεταβλητής διαμέτρου δημιουργώντας τη μωσαϊκή εμφάνιση του ώριμου μυϊκού συστήματος των ψαριών

Παρατηρήθηκαν τομές 10 ατόμων ανά ομάδα χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο συζευγμένο με μια ψηφιακή κάμερα και οι ληφθείσες εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Τα δείγματα ταξινομήθηκαν με βάση το ολικό μήκος (TL) ανά ομάδα ηλικίας και επιλέχθηκαν τυχαία αντιπροσωπευτικά δείγματα για κάθε κλάση μήκους. Σε κάθε δείγμα σε ένα ραχιαίο επαξονικό τεταρτημόριο του μυοτόμου μετρήθηκε η συνολική επιφάνεια διατομής (TCSA) αυτού του τεταρτημορίου (Εικόνα 1).

Εικόνα 1. Αντιπροσωπευτική τομή και εικόνα της επιφάνειας διατομής του τεταρτημορίου που μελετήθηκε.

Τόσο η τροφή όσο και η θερμοκρασία φαίνεται να επηρέασαν των αναπτυξιακό ρυθμό των ιχθυονυμφών (Εικόνα 2).

Οι ιχθυονύμφες των 20 °C που ταΐστηκαν με κωπήποδα ήταν αυτές με τον γρηγορότερο ρυθμό ανάπτυξης στο σύνολο του πειράματος ενώ αντίθετα αυτές που ταΐστηκαν με τροχόζωα είχαν τον πιο αργό. Στους 24 °C ενώ παρατηρήθηκαν αναπτυξιακές διάφορες αναμεσά στις δυο τροφές, τα άτομα κα των δυο ομάδων έφτασαν στο στάδιο ΜΜ την ίδια ημέρα (35).

Η μετάβαση στο στάδιο της έναρξης της εξωγενούς τροφοληψίας (FF) φαίνεται να επηρεάζεται από την θερμοκρασία καθώς οι ομάδες των 24°C έφτασαν σε αυτό νωρίτερα, γεγονός που υποδεικνύει την ευαισθησία αυτού του αναπτυξιακού σταδίου σε μεταβολές της θερμοκρασίας.

Τέλος, η τροφή φαίνεται να επηρεάζει την μετάβαση από το στάδιο FL στο ELR όπου παρατηρείται καθυστέρηση στις ομάδες που ταΐστηκαν με τροχόζωα και στις δυο θερμοκρασίες, ενώ παράλληλα παρατηρείται και επίδραση της θερμοκρασίας σε αυτή την μετάβαση η οποία φαίνεται να συμβαίνει νωρίτερα στους 24 °C συγκριτικά με τους 20 °C.

Εικόνα 2. Αναπτυξιακό χρονοδιάγραμμα ανά θερμοκρασία και τροφή.

Το αποτέλεσμα της εκτροφή στους 20^oC δεν επηρεάστηκε από τον τύπο της ζωντανής τροφής. Αντιθέτως, το αποτέλεσμα της εκτροφής σε αυξημένη θερμοκρασία επηρεάστηκε σημαντικά από τον τύπο της ζωντανής τροφής με τις ιχθυονύμφες που τράφηκαν με κωπήποδα να υστερούν σε μέγεθος στο στάδιο FL και να συνεχίζουν να έχουν μικρότερο μέγεθος από αυτές του τράφηκαν με τροχόζωα ακόμα και το στάδιο ΜΜ (Εικόνα 2).

Σε επίπεδο μυογένεσης ωστόσο, τα αποτελέσματα επιδεικνύουν μια διαφορετική επίδραση της τροφής καθώς το TCSA ήταν μεγαλύτερο σε ιχθύδια που τράφηκαν με κωπήποδα. Αυτό μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα ιχθύδια με διαφορετικά σχήματα, δηλαδή πιο κοντά και με πιο στρογγυλή εγκάρσια διατομή.

Προέκυψαν επιπλέον μια σειρά στατιστικώς σημαντικά γονίδια τα οποία είτε υπερεκεφράζονται είτε υποεκφράζονται στην υπό σύγκριση συνθήκη. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε 33 γονίδια τα οποία διαφέρουν στατιστικά στις δύο υπό μελέτη συνθήκες. Παράλληλα, τα αποτελέσματα οπτικοποιήθηκαν σε διαγράμματα τύπου volcano (Γράφημα 1).

Γράφημα 1. Διάγραμμα τύπου volcano για την οπτικοποίηση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων. Ο κάθετος άξονας απεικονίζει τον λογάριθμο του διορθωμένου p-value (padjust) και ο οριζόντιος άξονας τον λογάριθμο της μεταβολής της έκφρασης των γονιδίων. Με κόκκινο χρώμα απεικονίζονται τα υπερεκφρασμένα γονίδια και με πράσινο χρώμα τα υποεκφραζόμενα γονίδια της 2ης σύγκρισης έναντι της 1ης.

Η ανάλυση των αποτελεσμάτων της αλληλούχησης ολόκληρου του μεταγραφώματος για τα δείγματα τα οποία είναι ενδεικτικά για τις δυο θερμοκρασίες εκτροφής ανέδειξε έναν αριθμό γονίδιων (33) τα οποία εντοπίζονται διαφορικά εκφρασμένα.

Η διαφοροποίηση στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που εντοπιστήκαν κυμαίνεται από 3 έως 11 φορές (μικρότερη ή μεγαλύτερη) μεταξύ των δυο θερμοκρασιών γεγονός που υποδεικνύει ότι η επίδραση της θερμοκρασίας είναι ιδιαίτερα ισχυρή στην ρύθμιση της έκφρασης ορισμένων γονιδίων.

Τα περισσότερα γονίδια φαίνεται να εκφράζονται σε χαμηλότερο βαθμό στους 20°C σε σχέση με τους 24°C και ανάμεσα σε αυτά τα γονίδια εντοπίζονται οι μεγαλύτερες διάφορες. Ανάμεσα στα γονίδια με τις μεγαλύτερες διαφορές μεταξύ των δυο θερμοκρασιών εντοπίζονται γονίδια που σχετίζονται μεταξύ άλλων με τον κυτταροσκελετό (krt18a.2), με την ρύθμιση της ανάπτυξης (tspan34) καθώς και στην διαμόρφωση ιστών (muc13b).

Από την ανάλυση εμπλουτισμού στην οποία λαμβάνεται υπόψη το σύνολο των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων και διερευνάται σε ποιες βιολογικές λειτουργίες συμμετέχουν, εντοπιστήκαν τρεις κύριες βιολογικές λειτουργίες οι οποίες φαίνεται να επηρεάζονται από την θερμοκρασία:

• • ο σχηματισμός και η διαμόρφωση του κυτταροσκελετού,

• • η κυτταρική προσκόλληση και

• • ο μεταβολισμός λιπιδίων.

Η ανάπτυξη του κυταροσκελετού και ειδικότερα των ενδιάμεσων ινιδίων (νημάτια) καθώς και η κυτταρική προσκόλληση διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη και την αύξηση. Tα ενδιάμεσα ινίδια παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της δομικής ακεραιότητας των κυττάρων και των ιστών κατά την ανάπτυξη των ψαριών και είναι απαραίτητα για τον σωστό σχηματισμό και λειτουργία διαφόρων δομών στο σώμα του ψαριού.

Η κυτταρική προσκόλληση είναι η διαδικασία με την οποία τα κύτταρα συνδέονται μεταξύ τους καθώς και με στοιχεία της εξωκυτταρικής μήτρας και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε διάφορες αναπτυξιακές διαδικασίες στα ψάρια. Κάποιες από αυτές τις διαδικασίες είναι η

• • επιθηλιακή μορφογένεση, μια κρίσιμη διαδικασία η οποία συμμετέχει στην ανάπτυξη διαφόρων δομών όπως το έντερο, το δέρμα και τα πτερύγια,

• • η μυογένεση, και

• • ο σχηματισμός εξωτερικών οργάνων όπως πτερύγια, λέπια και δέρμα.

Συμπερασματικά η κυτταρική προσκόλληση είναι σημαντική για την αναδιαμόρφωση των ιστών και των οργάνων που συμβαίνει κατά τη διάρκεια της μεταμόρφωσης.

Τέλος η τρίτη βιολογική διαδικασία η οποία φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά από την θερμοκρασία, ο μεταβολισμός λιπιδίων, είναι μια διαδικασία με ιδιαίτερο ρόλο κατά την ανάπτυξη. Ο μεταβολισμός των λιπιδίων παίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη των ψαριών, καθώς παρέχει ενέργεια για την ανάπτυξη και την αύξηση, καθώς και ως αποθηκευτική μορφή ενέργειας για μελλοντική χρήση. Τα λιπίδια είναι επίσης σημαντικά για το σχηματισμό των κυτταρικών μεμβρανών και το σχηματισμό των μυελικών στρωμάτων των νεύρων.

Αρκετά από τα γονίδια που εντοπίστηκαν και συμμετέχουν στις διαδικασίες που αναφέρθηκαν παραπάνω φαίνεται να εκφράζονται σε χαμηλότερα επίπεδα στα ψάρια που μεγάλωσαν στους 20°C από ότι στους 24°C υποδεικνύοντας τους 24°C ως βέλτιστη θερμοκρασία εκτροφής τουλάχιστον όσον αφορά τις βιολογικές λειτουργίες που αναφέρθηκαν.